Zbyňousovy stránky - Cytometrie nového taxonu bělokvětého prstnatce ze severní části Beskyd

Cytometrie nového taxonu bělokvětého prstnatce ze severní části Beskyd

(Tento článek byl publikován ve zkrácené formě v časopisu Roezliana č. 44 v roce 2014 a je zakázáno publikovat části bez souhlasu autora bez řádných citací).

     Bělokvěté prstnatce jsou v Moravskoslezských Beskydech velice hojné a na některých lokalitách tvoří i většinu z celé populace, kdežto například na lokalitách na Šumavě se vyskytuje klasická forma s kresbou na pysku. Většinou se tato bílá forma považuje za Dactylorhiza fuchsii subsp. fuchsii.
   Bílé prstnatce nacházím na lokalitách již od počátku 90. let v oblasti Podolanek, postupem času jsem je nacházel i na jiných lokalitách v Beskydech a Podbeskydské pahorkatině. V literatuře o bílých prstnatcích z Beskyd nebylo mnoho publikováno, z literatury je známa forma rostliny, která byla popsána jako D. fuchsii subsp. beschdica [1] (někdy také v literatuře beskidika či beskidiensis), v roce 2007 byly na některých lokalitách severních Beskyd nalezeny a popsány prstnatce D. maculata subsp. transsilvanica např. v [2]. Zájem o problematiku bělokvětých prstnatců u mne nastal v roce 2011, kdy jsem navštívil malou lokalitu u přehrady Šance, kde jsem si všiml subtilních bělokvětých rostlin, které měly květy „fuchsoidního“ tvaru, jejich klas byl řídký a svým habitem připomínal spíše prstnatec plamatý sedmihradský. O rok později jsem tyto rostliny našel i na další lokalitě v Podbeskydské pahorkatině, kde se vyskytují mezi ostatními bílými prstnatci, avšak jsou od nich docela dobře rozpoznatelné.
     Letos jsem proto navštívil přes 15 lokalit na severní straně Beskyd, přičemž subtilní bílé prstnatce jsem nalezl pouze na třech z nich. Omezil jsem se spíše na menší populace z důvodu zmenšení hybridizace mezi druhy prstnatců. Ve spolupráci s Ústavem Botaniky a zoologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy Univerzity v Brně, jsem se domluvil na možnosti měření hmotností jádra na základě fluorescence za užití barviv PI a DAPI na cytometru CyFlow ML (výrobce Partec). Tyto metody potřebují minimální velikost vzorku (stačí kousek listu) a pro rostlinu nepředstavuje žádné ohrožení.

Metoda měření:
     Pro určení relativní velikosti genomu byla využita průtoková cytometrie (ML, Partec GmbH) s interní standardizací. Měřeny byly čerstvé listy rostlin. Ke stanovení byla použita fluorescenční barviva – nespecificky interkalárně se vázající propidium iodid a AT-selektivní DAPI – ve dvoukrokové metodě s pufry Otto I a Otto II [6].
     Byla provedena dvě měření, v prvém se porovnávaly 4 vzorky ze dvou lokalit, poté byly tyto vzorky porovnávány s třemi referenčními vzorky prstnatců. Názvy těchto lokalit jsem zvolil pouze oblastní bez lokální specifikace z důvodu ochrany rostlin a společenstev.
     Většina odebraných vzorků prstnatců pochází z pravidelně kosených lučních podmáčených stanovišť, kde roste společně s prstnatcem májovým, který je na lokalitách udáván. Pouze Vzorek 6 je z lesního stanoviště, žádné další druhy prstnatců v okolí nejsou známy (nejbližší je lokalita D. majalis vzdálená přes 3 km).

Popis vzorků:
Vzorek 1: Lokalita „Podbeskydská pahorkatina“ – Dactylorhiza fuchsii – nejrozšířenější bílá forma v Beskydech, výška rostlin 30-40 cm, střední část pysku protáhlá, barva brylek nafialovělá, květenství je hustý klas, květy čistě bílé nebo lehce narůžovělé s lehkou kresbou, listy širší, 10–15 cm dlouhé, na konci tupé nebo zakončené tupou špičkou, vždy bez skvrn nebo náznaku – Obr. 1. Tato bílá forma roste především v horských pásmech Beskyd, do Podbeskydské pahorkatiny zasahuje spíše výjimečně. Je známa z mnoha chráněných území, vyskytuje se roztroušeně po celém území Beskyd.

Obr. 1 Dactylorhiza fuchsii – klasická forma. Lokalita : Podbeskydská pahorkatina

Vzorek 2: Lokalita „Podbeskydská pahorkatina“ – Dactylorhiza fuchsii – „beskydská“ forma, v [1] uváděná jako Dactylorhiza fuchsii subsp. beskidiensis, je však známá i z dalších lokalit na pomezí Karpat. V literatuře [2] je tato rostlina označována jako kříženec mezi p. Fuchsovým a plamatým. Stavbou se podobá bílé formě prstnatce Fuchsova, liší se od něj barvou květů, přičemž střední část pysku je bílá, okrajové jsou růžové až světle fialové. – Obr. 2. Vyskytuje se spolu s prstnatcem Fuchsovým především v horských částech Beskyd, zasahuje však i do nižších poloh.

Obr. 2 Dactylorhoza fuchsii „beskydská forma“ . Lokalita: Podbeskydská pahorkatina

Vzorek 3: Lokalita „Podbeskydská pahorkatina“ - Bílá subtilní forma, krátký květní klas, „fuchsoidní“ pysk květů, 17 cm výška, 10 květů na stvolu. Popis rostlin viz část Popis subtilního druhu. Svým tvarem je tento habitus mezi různě zbarvenými květy prstnatců jasně rozeznatelný, především malým vzrůstem a řídkým klasem. Po dobu 2 let sledování populace rostliny téměř neměnily svou výšku ani počet květů. Počet rostlin na lokalitě je 5 a tvoří zhruba dvě procenta populace prstnatců.

Vzorek 4: Lokalita „Beskydy“ - Bílá subtilní forma, krátký květní, „fuchsoidní“ pysk květů, 13 cm výška, 8 květů na stvolu, Obr. 3–4. Na této lokalitě sledované 3 roky se vyskytuje průměrně 15 rostlin (v roce 2013 pouze 6), celkově tato forma tvoří 10-20 procent populace.

Obr. 3 Subtilní forma taxonu prstnatce – detail květů již žlutými brylkami Lokalita: Beskydy

Obr. 4 Subtilní forma taxonu prstnatce – srovnání rostlin s odkvetlým prstnatcem májovým. Lokalita: Beskydy

Vzorek 5: Lokalita „Záhorie“ – Dactylorhiza maculata subsp. transsilvanica – klasická forma poddruhu se žlutými pysky, sběr proběhl po pokosení lokality z fertilních rostlin. Pozice těchto rostlin znám z minulých návštěv zadané lokality, kdy rostliny kvetly.

Obr. 5 Prstnatec plamatý sedmihradský - Záhorie (foceno 2011)

Vzorek 6: Lokalita „Moravský kras“ – Dactylorhiza fuchsii subsp. fuchsii – nominatní forma se skvrnitými listy, 20 rostlin. V okolí není znám výskyt dalších druhů prstnatců, populaci můžeme považovat za nominatní.

Obr. 6 Prstnatec Fuchsův pravý - nominální forma

Vzorek 7: Lokalita „Záhorie“ – Dactylorhiza majalis subsp. majalis – sběr po pokosení lokality, původně sbíráno pro srovnání s nominatním druhem prstnatce plamatého. Ačkoliv se jedná o jiný druh prstnatce, výsledky ponechávám v tabulce na srovnání. Relativní velikost genomu je uvedena vzhledem ke dvěma standardům (Bellis, Bob).

Obr. 7 Prstnatec májový pravý - Lokalita: Záhorie 2013

Výsledky měření:
V následující tabulce je srovnávání poměrů hmotnosti jádra vůči hmotnosti chudobky (Bellis)

Vzorek	Krátký popis	Lokalita	PI (Bellis)	DAPI (Bellis)
Vzorek 1	Dactylorhiza fuchsii - hustokvětá bílá forma	Podbeskydská pahorkatina	3,479981127	2,637943916
Vzorek 2	Dactylorhiza fuchsii - růžové vnější části pysku	Podbeskydská pahorkatina	3,508562219	2,646379387
Vzorek 3	Subtilní forma - sledováno 2 roky	Podbeskydská pahorkatina	3,389100041	2,563032326
Vzorek 4	Subtilní forma - sledováno 3 roky	Beskydy	3,39614263	2,563999404
Vzorek 5	Dactylorhiza maculata subsp. transsulvanica	Záhorie	3,442748092	2,574053533
Vzorek 6	Dactylorhiza fuchsii subsp. fuchsii - nominální druh	Moravský kras	3,257709533	2,510858737
Vzorek 7	Dactylorhiza majalis subsp. majalis - srovnání	Záhorie	nezměřeno	3,164822561 0,42954598

Podrobné vlastností měření lze zjístit v následujících tabulkách.

Obr. 8 Použité vzorky pro cytometrii (po docela dlouhé době)

Závěry:
     Studiem bílých prstnatců se u nás zabývají např. v [4], kde statisticky rozebírají velikosti rostliny, listů a květů. Výsledky napovídají značnému rozpětí ve variabilitě, což rovněž odpovídá hybridnímu původu. V práci je rovněž použité jiné vyhodnocení měření cytometrem, které však nerozlišuje mezi nominatními druhy.
     Po prvním měření (Vzorek 1–4) bylo zjištěno, že se povedlo najít v bílých formách prstnatce Fuchsova formu, která se liší od nejhojnější velké bílé formy i formy s růžovým okrajem. Velice zajímavé zjištění je v naprosté shodě metod PI a DAPI subtilních prstnatců z lokalit vzdálených 17 km. Při srovnání s D. maculata subsp. transsilvanica metoda PI se v hmotnosti jádra liší, metoda DAPI je podobná. Z toho lze usuzovat na blízkou příbuznost s prstnatcem plamatým sedmihradským.
     Srovnání s majoritní formou prstnatce Fuchsova pravého (v okolí nejsou známy bílé formy tohoto prstnatce) lze vyvodit závěry, že většina bílých prstnatců jsou hybridního původu mezi prstnatcem plamatým sedmihradským a prstnatcem Fuchsovým pravým. To potvrzují i fotografie tohoto křížence např. na [3], kde se vyskytují světlé a bílé formy.
     Dle mého osobního názoru subtilní bělokvětý prstnatec vznikl hybridizací prstnatce Fuchsova a prstnatce plamatého sedmihradského a jeho genom můžeme považovat za stabilní, o čemž svědčí výsledky analýzy ze dvou různých lokalit. Dle pracovníků MU výsledky metody napovídají, že se jedná o geneticky rozdílné rostlinné taxony. Podrobné data měření, další fotografie lze najít v [5]. Zde bych skončil citátem z díla Járy Cimrmana: Můžeme o tom diskutovat, můžeme o tom vést spory a můžeme s tím nesouhlasit, ale to je tak všechno, co proti tomu můžeme dělat.

Popis subtilního prstnatce:

     Rostliny (10)12-17(20) cm dlouhé, lodyhy přímé, počet listů (4)6–8(10) (včetně listů listenům podobných), přízemní úzce obkopinaté až úzce obvejčité, 6–8 × 1–1,5 cm dlouhé, většinou nad 1/2 délky nejširší, na vrcholu tupé, oboustranně světle zelené, vždy neskvrnité, horní lupenité listy čárkovitě kopinaté. Květenství řídké, 6–10(12)-květé, podlouhlé, válcovité. Květy krémově bílé, výjimečně s naznačenou kresbou na bočních lalocích pysku. Pysk 18–12 (–13) mm dlouhý, (10–)14–16 mm široký, na bázi nebo i ve střední části žlutavý, zpravidla bez kresby, mělce dělený, trojlaločnatý, střední lalok úzký a delší postranní, ostrý, mírně vpřed protažený, postranní laloky široké, zaokrouhlené, zoubkované, částečně sklopené dozadu. Brylky po rozkvětu růžovofialové, u starších květů blednou a přecházejí do žluté. Ostruha tenká, 8–10 mm dlouhá a 1,5–3 mm v průměru, délky 3/4 nebo celého semeníku, vakovitá, směřující ostře vzhůru. Kvete od půlky června do půlky července.
Stanoviště:
     Mírně vlhké až mokré slatinné louky, lesní okraje a světlé lesy, půdy kyselé až slabě kyselé, lesní rašeliniště, střední polohy Beskyd a Podbeskydské pahorkatiny.

Literatura:
[1]    Potůček, O., Čačko, L.Všechno o orchidejích, Slovart, Praha, 1996,ISBN: 80-85871-43-2
[2]    Hadinec, J., Lustyk, P. Additamenta ad floram Reipublicae Bohemicae. VIII. Zprávy Čes. Bot. Společ., Praha, 44: str. 230, 2009.
[3]    Internetová stránka www.orchids.de
[4]    Taraška, V. Karyologická a morfologická studie vybraných populací okruhu Dactylorhiza maculata, PřF UP v Olomouci, katedra Botaniky, 2012.
[5]    Internetová stránka www.zbynous.net
[6]    Otto, F. DAPI staining of fixed cells for high resolution flow cytometry of nuclear DNA. – In: Crissman HA, Darzynkiewicz Z, eds. Methods in cell biology 33: 105–110. Academic Press, New York, 1990

Poděkování:
Tímto bych rád poděkoval Mgr. Pavlu Veselému za zprostředkování měření na cytometru, Radimu Poledníkovi za užitečné připomínky a Petře Solné, která se mnou většinu lokalit navštívila.